Учебно-исследовательская работа Клональное размноженение ежевики

Клональное микроразмножение ежевики и малино-ежевичных гибридов

Введение

1.Актуальность темы. В последние годы среди населения увеличился интерес к таким нетрадиционным культурам как ежевика и малино-ежевичные гибриды, обладающие большой урожайностью, высокими вкусовыми качествами; и которые в отличие от распространенной у нас малины в меньшей степени подвержены заболеваниям.

В ягодах ежевики содержится 2,9-3,6 % глюкозы, 3,1-3,3 % фруктозы, 0,4-0,6 % сахарозы, а также каротин, тиамин, аскорбиновая кислота, 0,56-0,8 % пектинов, 1,1-2,3 % органических кислот (яблочная, лимонная, винная, салициловая), биофлавоноиды, никотиновая кислота, филохинон, минеральные вещества (калий, магний фосфор и др.). Семена ежевики содержат до 12 % жирного масла.

Ежевика обладает вяжущим свойством. Растение обладает мочегонным, потогонным, общеукрепляющим, противовоспалительным, жаропонижающим свойствами, успокаивающе действует на центральную нервную систему.

Традиционно эти растения размножают верхушечными отводками, корневыми отпрысками, корневыми и зелеными черенками, делением куста. Перечисленные способы имеют низкий коэффициент размножения и не дают возможности освобождения растений от вирусной инфекции.

Метод культуры тканей - современный биотехнологический способом размножения, позволяющий многократно увеличивать коэффициент размножения и получать оздоровленный посадочный материал.

Цель и задачи работы. Цель работы - изучить свойства и оптимизировать условия клонального микроразмножения ежевики и малино-ежевичных гибридов.

Задачи:

1) определить оптимальные условия введения в культуру эксплантов ежевики и малино-ежевичных гибридов;

2) оценить регенерационную способность сортов на этапе пролиферации;

3) оценить способность растений к укоренению и адаптации к нестерильным условиям;

2.Биологические особенности ежевики

Ежевику, так же как и малину, относят к полукустарникам. Надземная часть ее куста живет два года, а подземная - многолетняя. Виды ежевик очень изменчивы вследствие резко протекающих гибридизационных процессов. По направленности роста ежевики делятся на две группы: группа росяник, имеющих стелющийся стебель (побег), и группа собственно ежевик с прямостоячим стеблем (побег). Имеются и гибридные формы с полустелющимися стеблями. По высоте и мощности куста сорта ежевик также сильно варьируют. Одногодичные побеги различны по цвету, опушенности, шиповатости и железистости. Они бывают зеленой окраски, с красными или коричневыми оттенками, покрыты шипами различной величины, формы и окраски.

Листья варьируют по опушенности, цвету и форме листочков. Листья имеют три, пять или семь листочков (долек). Соцветие - длинная или короткая кисть или тип полузонтика, много - или малоцветковые, облиственные или без листьев.

Плод, как и у малины, сборная костянка. Он изменчив по величине, форме (рис. ) и цвету. Плоды по окраске бывают черными, пурпуровыми, красными и желтыми. Костянки ежевики в отличие от малины срастаются не только между собой, но и с плодоложем. Плоды обычно крупные, у стелющихся ежевик более вкусные, чем у прямостоячих.

2.1. Особенности клонального микроразмножения плодово-ягодных культур

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения - клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro, т.е. в пробирке, неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру), позволяющего наиболее полно реализовать потенциал растительного организма. В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность, т.е. под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

Метод клонального микроразмножения имеет ряд преимуществ перед существующими традиционными способами размножения (Говорова, 1996):

- получение генетически однородного посадочного материала;

- освобождение растений от переносчиков системных болезней;

- высокий коэффициент размножения (сотни тысяч растений от одной меристемы в год);

- ускорение селекционного процесса в два-три раза за счет сокращения сроков размножения новых форм растений;

- возможность проведения работ в течение круглого года без контакта с внешней средой и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала;

- возможность автоматизации процесса размножения.

Выделяют следующие типы клонального микроразмножения: 1) размножение пазушными побегами при различных способах снятия апикального доминирования - путем простого черенкования (удаления верхушки), применения повышенных концентраций цитокинина или ингибиторов транспорта ауксинов; 2) размножение путем образования адвентивных почек, побегов или эмбриоидов непосредственно в тканях эксплантов. Вариантом этого типа размножения является также закладка микроклубней и микролуковичек; 3) регенерация растений из каллусной или суспензионной культур путем образования стеблевых почек или эмбриоидов.

Процесс микроразмножения растений состоит из ряда последовательных операций 1) выделение экспланта и введение в культуру in vitro; 2) пролиферацию побегов на среде для размножения; 3) укоренение размноженных побегов и 4) перенос укорененных растений в нестерильные условия.

Полная стерильность исходного материала - необходимое условие нормального развития эксплантов при введении их в культуру in vitro. Для освобождения от микроорганизмов (грибов, бактерий, микоплазм) растительный материал подвергают поверхностной стерилизации в растворах хлор- и ртутьсодержащих препаратов (сулема, диацид, гипохлориты кальция, натрия, калия) и промывают стерильной дистиллированной водой.

При разработке методов клонального микроразмножения растений необходимо учитывать влияние генетических, физиологических, гормональных и физических факторов. Это связано с тем, что методика, разработанная для определенного вида, не всегда может быть применена для размножения других представителей этого вида и тем более растений других видов.

2.2 Клональное микроразмножение ежевики

Для работы с культурой верхушечных меристем ежевики необходимо соблюдать следующие правила: на этапе введения эксплантов в культуру использовать пробирки диаметром 14-16мм ; развивающиеся экспланты пересаживают в пробирки диаметром 20-22 мм.

Для клонального микроразмножения ежевики наиболее подходит питательная среда на основе минеральных солей Мурасиге-Скуга, обогащенная витаминами, сахарозой и регуляторами роста.

3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Объекты исследования

Работа проводилась в научно-образовательном центре биотехнологии Брянской государственной сельскохозяйственной академии.

Объектом исследования являлись 2 сорта ежевики (Торнфри и Торнлесс Эвергрин) и 4 малино-ежевичных сорта (Бойсенберри, Тэйберри, Логанберри и Санберри).

3.2 I этап

Техника размножения ежевики в культуре in vitro:

Приготовление и стерилизация питательной среды

Питательная среда для культивирования растений на всех этапах раз-множения готовилась с использованием десятикратного маточного раствора макро- и микроэлементов по Мурасиге-Скугу.

Подготовка растительного материала для введения в культуру in vitro.

нарезку черенков ежевики и малино-ежевичных гибридов осуществляли осенью за несколько дней до изолирования эксплантов (сентябрь).

Стерилизация материала

нарезанные черенки стерилизовали в 0.1% растворе мертиолята. После стерилизации черенки обсушивали на стерильных кружках фильтровальной бумаги в ламинарном шкафу.

Изолирование эксплантов

Изолирование проводили в условиях ламинарного шкафа ЛШ-2. Для вычленения эксплантов использовали бинокулярный микроскоп МБС-9. В качестве источников эксплантов испытывали целые почки (5-8 мм) без нескольких кроющих чешуй, которые отсекались от черенка с помощью глазного скальпеля.

Культивирование эксплантов осуществляли на питательной среде Мурасиге-Скуга

Пробирки, для сохранения стерильности и уменьшения испарения воды из питательной среды, закрывали пищевой пленкой в два слоя.

Через 1-2 месяца культивирования учитывали следующие показатели:

- частота контаминации - доля культуральных сосудов с микробиологическим зарастанием, %;

- частота приживаемости эксплантов - доля погибших эксплантов без учета инфицированных, %;

- высота регенерантов - высота почек или стеблей образовавшихся в течение учетного периода, мм;

- количество образовавшихся регенерантов на эксплант, шт. - число почек и стеблей, образовавшихся в течение учетного периода.

Микрочеренкование и субкультивирование растений:

В условиях ламинарного шкафа готовые к черенкованию растения стерильным крючком вынимала из пробирки и помещала на кружок фильтровальной бумаги. С помощью скальпеля и пинцета пучок побегов разделялся на отдельные черенки, которые на несколько миллиметров погружались в свежую питательную среду.

II этап

На этапе размножения(пролиферации) через месяц учитывала следующие показатели:

- коэффициент размножения - среднее количество образовавшихся побегов на одном растении;

- высоту растений, см;

- количество листьев, шт.

III этап

Этап элонгации,на этом этапе получают крупные побеги

IV этап укоренения,адаптации к нестерильным условиям

На этапе укоренения учитывали:

- количество укорененных растений, %;

- количество корней, шт.;

- длину корней, см;

- высоту растений, см.

Перенос пробирочных растений в субстрат и их адаптация к не стерильным условиям: укорененные растения крючком вынимали из про-бирки и пересаживали в минипарнички (пластиковые стаканчики, накрытые прозрачной крышкой) наполненные предварительно увлажненным готовым субстратом. (4 марта) Периодически проводили полив и опрыскивание растений. Через 1.5-2 месяца окрепшие растения распикировали в горшки с почвой, заполненные субстратом. (10 апреля) С наступлением положительных температур в весенне-летний период высадили в открытый грунт. Создали затенение,т.к. от прямых лучей они бы погибли. Далее в течении двух недель вели пристальное наблюдение за укоренением и адаптацией в открытом грунте. (10 июня)

При адаптации растений учитывались следующие показатели:

- приживаемость растений, %;

- высоту растений, см;

- число листьев, шт.

4.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1 Введение ежевики и малино-ежевичных гибридов в культуру in vitro

Для всех 6 сортов был получен положительный результат на этапе культивирования первичных эксплантов. Частота контаминации при стерилизации мертиолятом варьировала от 11% до 50%. По количеству регенерировавших побегов на среде МС испытанные сорта существенно не отличались и в среднем этот показатель составил 1,4 дополнительных побега. Самые крупные побеги формировались у сорта Торнлесс Эвергрин ( 9,9мм ), а самые мелкие у гибрида Лаганберри (5,3мм) (табл. ).

Таблица 1 - Результаты введения в культуру in vitro ежевики и

малино-ежевичных гибридов

№ п.п.

Сорт

Дата изолирования

Количество изолированных эксплантов, шт.

Частота контаминации, %

Количество почек на эксплант, шт.

Высота растений, мм

Ежевика

1

Торнфри

25.09

45

11,1

1,4±0,15

7,7±0,30

2

Торнлесс Эвергрин

24.09

40

50

1,3±0,12

9,9±0,53

Малино-ежевичные гибриды

3

Бойсенберри

24.09

50

38,0

1,6±0,13

8,2±0,48

4

Тайберри

25.09

47

12,8

1,5±0,09

6,5±0,27

5

Санберри

24.09

47

19,1

1,7±0,11

7,7±0,39

6

Логанберри

21.09

43

44,2

1,1±0,06

5,3±0,28

Уже на первом этапе культивирования, сорта проявили морфологические отличия. Изолированные почки Торнлесс Эвергрин формировали удлиненные утолщенные черешки с деформированными листьями (Рис. 7).

Экспланты сорта Торнфри образовывали крупные, темно-зеленые листья с характерной зубчатой пластинкой (Рис. 8). Остальные сорта имели на первом этапе культивирования схожие признаки.

4.2 Этап пролиферации растений ежевики и малино-ежевичных гибридов

Для размножения ежевики и малино-ежевичных гибридов использовали питательную среду по прописи Мурасиге-Скуга. Коэффициент размножения варьировал от 2,3 у гибрида Логанберри и 8,7 у гибрида Санберри (в среднем 5-6). На этом этапе еще более четко проявились морфологические особенности каждого генотипа.

Таблица 2 - Коэффициент размножения и высота растений

в культуре in vitro

№ п.п.

Сорт

Коэффициент

размножения

Высота растений, мм

Ежевика

1

Торнфри

4,8 ± 0,68

20,9 ± 1,21

2

Торнлесс Эвергрин

3,4 ± 0,64

12,9 ± 1,33

Малино-ежевичные гибриды

3

Бойсенберри

7,5 ± 0,63

17,6 ± 1,39

4

Тайберри

±

11,7 ± 0,89

5

Санберри

8,7 ± 0,83

18,8 ± 1,27

6

Логанберри

2,3 ± 0,31

18,2 ± 1,33

4.3 Элонгация побегов и адаптация растений к нестерильным условиям культивирования

В нашей работе этап укоренения мы сочетали с этапом адаптации, т.е. высаживали растения непосредственно в грунт. Для получения более крупных растений на последнем этапе культивирования in vitro мы вводили дополнительный этап элонгации (или вытягивания побегов). Часть растений на безгормональной среде спонтанно укоренялись с различной эффективностью в зависимостью от сорта. Доля укорененных растений у гибрида Санберри составила 6,2%, 13,7% у гибрида Тайберри, 23,8% у сорта Торнфри, 55,9% у гибрида Бойсенберри, а сорт Торнлесс Эвенгрин не образовал корней. Высота растений в среднем составила (…..). количество листьев … шт. на растение.

Качество растений на этапе элонгации

№ п.п.

Сорт

Доля укорененных

растений, %

Высота растений, мм

Количество

листьев, шт.

Ежевика

1

Торнфри

23,8

18,5±1,03

7,9±0,41

2

Торнлесс Эвергрин

0

12,7±0,82

5,1±0,23

Малино-ежевичные гибриды

3

Бойсенберри

55,9

15,1±0,65

7,5±0,63

4

Тайберри

13,7

13,7±0,82

4,5±0,19

5

Санберри

6,2

14,4±0,70

9,2±0,61

6

Логанберри

±

±

Заключение

Мной отработана эффективная технология клонального микроразмножения ежевики и малино-ежевичных гибридов, позволяющая за 6 субкультивирований получать до нескольких сот тысяч растений.

В результате своей работы я сделала следующие выводы:

1) Для стерилизации ежевики и малино-ежевичных гибридов следует использовать в качестве антисептика 0,1% раствор мертиолята;

2) Введены в культуру in vitro 2 сорта ежевики и 4 сорта малино-ежевичных гибридов;

3) Определены коэффициенты размножения исследуемых сортов: для сорта Торнфри он составил 4,8 ± 0,68, Торнлесс Эвергрин 3,4 ± 0,64 и т.д.;

4) Для вытягивания побегов после этапа пролиферации необходимо включать дополнительный этап элонгации. Для этого полученные микропобеги ежевики следует культивировать на безгормональной питательной среде;

5) Для адаптации следует использовать питательный грунт на основе торфа. Для предупреждения интенсивной потери влаги высаженное растений помещается в условий с 100% влажностью воздуха;

6)Изучила свойства и оптимизировала условия клонального микроразмножения ежевики и малино-ежевичных гибридов.